Z扫面是在标本的不同平面采集一系列图像，Z扫描是通过显微镜细调节螺旋的移动完成的，通常的方法是通过计算机控制的步进马达以预先设定的步距移动显微镜的镜台，采用宏程序采集一幅图像，以预设的距离移动焦距，采集第二幅图像，储存图像，而后再移动焦距，以这种方式进行图像采集和储存，直到所有需要采集的图像都采集完成。常从Z扫描图像系列中选择2-3幅图像进行数字化叠加使得特定结构得到特异显示，也可以很容易的将Z扫描图像以画面剪辑的方式进行显示。
        Z扫描图像可进一步处理成3D图像，这一方法现在用来阐明3D结构和组织功能之间的关系，因为要从激光扫描共聚焦显微镜的200张或更多的光学切片中看出复杂的互相连接的结构之间的关系非常困难。应注意用正确的步距采集图像，以反映标本的实际厚度。Z扫描的图像以数字方式记录，因此很容易进行标本的3D重建。